細胞內流式細胞術成功的策略
近年來，細胞內流式細胞術的應用有所增加，部分原因是免疫療法的日益普及，現在將細胞表面和細胞內標記物結合在同一個流式細胞術實驗中已成為普遍做法。本文評論了流式細胞儀分析的細胞內標記物的類型，並提供了成功檢測的提示。
不斷發展的方法
自 1970 年代以來，細胞內流式細胞儀一直存在，當時使用 吖啶橙進行細胞週期研究，並用熒光素二乙酸鹽監測細胞內 pH 值。然而，直到 1980 年， 基於抗體的檢測才出現細胞內標記物的首次報導，為該領域的重大進展鋪平了道路。現在，細胞內染色用於檢測許多不同的分析物。“典型的標誌物包括細胞因子、炎症介質、細胞內蛋白、核蛋白、轉錄因子、磷蛋白、DNA 和熒光蛋白表達，”Bio-Rad 高級應用科學家 Sharon Sanderson 說。“此外，還可以通過 DHR 測定等方法監測 pH 值、鈣水平、細胞週期進程、細胞增殖和代謝活性。”
揭示新見解
至關重要的是，使用流式細胞儀監測細胞內靶標可以產生使用傳統的批量群體分析方法（如蛋白質印跡或 ELISA）可能會被忽視的洞察力。“流式細胞術的一個主要優勢在於它可以識別單個樣本中的多個群體，”Cell Signaling Technology 流式細胞術組的科學家 Rob MacDonald 解釋道。“從異質細胞池開始，例如脾細胞或外周血單核細胞，研究人員可以使用針對 CD 標記的抗體來識別不同的亞群，同時還可以對細胞內標記進行染色。這種方法可以揭示差異表達的目標，這通常比廣泛或普遍表達的標記提供更有價值的信息。
固定和透化的後果
雖然檢測活細胞上的細胞表面標誌物相對簡單，但細胞內流式細胞術存在固有的挑戰。“細胞內流式細胞術需要固定細胞以維持其結構，然後進行透化以允許抗體試劑進入其靶標，”賽默飛世爾科技細胞生物學研發經理 Natalie Oxford 說。“固定可能會改變表位，這意味著針對錶面標記的抗體不再能夠結合，而透化可能會帶來更多問題。” 這些包括變性用於細胞鑑定的表面結合蛋白熒光團（例如，藻紅蛋白和別藻藍蛋白），其中使用乙醇或甲醇等有機溶劑進行透化，以及使用 Triton™ X-100 提供對核目標的訪問的細胞中蛋白質的意外浸出。Sanderson 補充說，與完整細胞相比，透化還可能導致細胞形態的喪失，從而導致前向 (FSC) 和側向散射 (SSC) 分佈發生變化，這需要研究人員調整 FCS 和 SSC 參數的 PMT 電壓，以確保它們仍然在規模上。
細胞內流式細胞儀的最佳實踐
已經開發了各種策略來提高研究人員細胞內流式細胞術成功的機會。MacDonald 評論說，一種久經考驗且值得信賴的方法是先用表面標記抗體對活細胞進行染色，然後再對細胞內分析物進行固定、透化和染色——記住要考慮前面提到的透化考慮因素。“小分子熒光團，如異硫氰酸熒光素和 Alexa Fluor®染料在通過甲醇透化步驟時保留其熒光特性，並且可以代替熒光蛋白使用，前提是它們與流式細胞儀的激光器和檢測器兼容，”他說。“或者，為了避免蛋白質熒光團變性的問題並節省時間，樣品可以在表面和細胞內標記同時染色之前進行固定和透化。在選擇這條路線之前，重要的是要確認表面標記抗體在用於固定和透化細胞時仍能產生準確的結果；對已知的陽性和陰性樣本進行比較研究並使用抗體製造商推薦的染色方案作為對照是一種快速簡便的檢查方法。”
與細胞表面染色相比，細胞內染色通常對更高的非特異性抗體結合和背景信號敏感。BioLegend 細胞分析產品經理 Kenta Yamamoto 建議比較不同的封閉試劑並增加洗滌步驟的數量，以盡量減少背景染色和滴定抗體，以確保最佳信噪比。“採用逐步方法優化您的細胞內流式細胞術實驗是關鍵，”他報告說。
“這應該涵蓋從樣本採集方法到數據分析的所有內容，值得考慮使用專門為細胞內染色應用開發的試劑。” 例如，他重點介紹了最近的Nature Communications 出版物，其中研究人員使用 BioLegend 的 Cyto-Fast™ Fix/Perm Buffer Set對 NK 細胞進行基於流式細胞術的分析，以確定這些對逆轉錄病毒免疫的貢獻。這項研究的結果表明，靶向 NK 細胞線粒體適應性可能代表了一種有效的逆轉錄病毒感染治療策略。
對照是細胞內流式細胞術的另一個重要考慮因素，尤其是用於評估背景染色的那些。“同型對照是為表面染色而開發的，可能不適合評估細胞內方案中的背景，”牛津指出。“正確繪製門的一種方法是確保在對經過任何刺激或其他處理的細胞進行染色時，將未經處理的細胞作為對照。有一個內部陰性對照也很有幫助 – 一群細胞不表達感興趣的目標，但經歷了與陽性細胞相同的處理和準備 – 用於細胞內染色實驗，以解釋處理之間的自發熒光的任何差異和未處理的細胞，或在同種型對照和特異性抗體之間。”
最後，Sanderson 強調應設計生物控制以顯示細胞內蛋白質的全方位表達。“在細胞因子檢測的情況下，可以在染色前將蛋白質轉運抑製劑如 Brefeldin A 或莫能菌素添加到細胞中幾個小時，”她說。“這允許積累通常會分泌的蛋白質，從而能夠對其進行檢測。如果細胞因子表達較弱和/或僅由一小部分細胞表達，則首選明亮的熒光團，二抗也可用於放大信號。”
細胞內流式細胞術的六個重要技巧
- 如果您計劃在固定和透化細胞上使用表面標記抗體，請確認它在固定後仍能識別其目標，並且熒光團標記與透化試劑兼容
- 一些常見的活性染料，例如 PI、7AAD 和 DAPI，不適合在固定方案中使用；嘗試用可固定的替代品替換這些染料，例如 BioLegend 的Zombie Dyes、Bio-Rad 的 VivaFix Cell Viability Assays、 Cell Signaling Technology 的 Ghost Dyes或 Thermo Fisher Scientific 的 LIVE/DEAD™ Fixable Viability Dyes
- 考慮使用專為細胞內染色應用開發的試劑，例如 BioLegend 的 Cyto-Fast™ Fix/Perm Buffer Set或 Cell Signaling Technology 的 細胞內流式細胞儀試劑盒
- 查看文獻以確定已被引用用於細胞內流式細胞術的抗體，例如用於研究 胃癌進展的 Thermo Fisher Scientific 的 IL-22 單克隆抗體 (22URTI)和 Cell Signaling Technology 的 Alexa Fluor ® 488 偶聯磷酸組蛋白 H3 (Ser10) (D2C8) XP ® Rabbit mAb 用於研究 有絲分裂過程中的細胞生物能量學
- 採用逐步優化工作流程的方法，確保條件能夠可靠檢測多路復用面板中的每個目標
- 始終使用合適的對照來驗證分析性能和驗證結果，包括未處理的細胞、內部陰性對照和顯示細胞內蛋白質全範圍表達的陽性對照
