蛋白 A 捕獲色譜的替代品

2022 年 8 月 8 日

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下游生物加工的第一步是通過離心或深度過濾進行收穫，以去除培養物中的細胞碎片，同時最大限度地減少產品損失。第二步，捕獲，專門從所有其他可溶性組分中去除所需產物，例如用過的培養基、副產物以及細胞和成分衍生的雜質。用於抗體捕獲的蛋白 A 樹脂的主導地位幾乎是既定的，但非免疫球蛋白治療性蛋白的出現正在導致逐漸轉向其他方式。

“對於單克隆抗體，使用蛋白 A 或蛋白 G 親和介質最容易實現捕獲，它們對 mAb 的 Fc 區域具有高度特異性，”安捷倫科技應用化學家 Andrew Coffey 博士說。“對於其他分子類型，找到對靶蛋白具有相似高特異性的親和介質可能更加困難。在某些情況下，可以設計一種蛋白質以結合合適的標籤，例如多組氨酸標籤或穀胱甘肽 S-轉移酶。”

這些物質與具有特定功能的親和樹脂結合，例如在多組氨酸標記的情況下固定化金屬如 Ni ^{2+ ，或固定化穀胱甘肽用於 GST 標記的蛋白質。}

開發時間、成本

設計一種基於非標準樹脂的新型純化工藝涉及開發時間和成本，有些方法可能會向監管機構發出危險信號，他們認為“產品就是工藝”。規模化開發肯定會涉及更多資源的支出，但創新公司將繼續嘗試，因為正如 Coffey 指出的那樣，“親和媒體通常是下游加工中最昂貴的成本。”

當缺乏合適的親和介質時，生物處理器可能會轉向肽和蛋白質的陽離子交換層析，或寡核苷酸的陰離子交換層析。“基於離子交換的純化沒有那麼具體，通常更好地保留在拋光步驟中，”Coffey 說。還有其他色譜選擇包括尺寸排阻、疏水相互作用色譜和混合模式色譜。這些技術通常用於拋光——去除痕量污染物和雜質，因此生物處理器已經熟悉它們。“膜和纖維也適用於一些不需要高分辨率的純化步驟，”他補充道。

平台純化

親和層析將始終是治療性蛋白質製造的一種選擇，尤其是單克隆抗體，因為它可以設計更廣泛適用的平台純化工藝，並且它能夠減少下游步驟的數量，同時提高產品回收率。

親和樹脂在商業上可用於非抗體療法，但根據 Purolite 生物加工部門業務發展和戰略主管 Andrew Masters 的說法，這些是特定於蛋白質組的，例如糖蛋白或特定類別的酶，而不是為單一分子類型。“用於組特異性親和力的配體包括肝素、鈣調蛋白、凝集素和模擬物，它們已被用於純化 ATP 酶、腺苷酸環化酶、激酶、絲氨酸蛋白酶、神經遞質和 DNA 結合蛋白等等。與蛋白 A 相比，這些樹脂通常對目標分子的結合能力較低，並且難以清潔。在製造規模上使用它們需要在性能、再利用潛力和整體工藝經濟性之間進行權衡。”

在親和樹脂不是一種選擇的情況下，開發人員應用標準純化方案，其中對各種樹脂（例如離子交換、HIC、混合模式）的選擇性進行單獨篩選，以確定它們捕獲目標的能力。

“捕獲的目標是快速濃縮目標分子，並去除大量污染物和蛋白酶，”Masters 補充道，“這就是為什麼通常選擇高容量離子交換樹脂（通常包含磺丙基或季胺化學物質）的原因。陽離子交換對來自微生物表達的靶標特別有用，因為帶負電荷的配體不會結合 DNA 或內毒素。”

蛋白 A 替代品

隨著基於抗體的療法的多樣性增加，更多設計用於與不含 fc 的片段或結構域結合的親和樹脂正在進入市場。“動態結合能力的提高、更溫和的洗脫條件以及對原位清洗操作的 NaOH 耐受性正在推動這些樹脂在製造過程中的應用，”Masters 告訴 Biocompare。“從歷史上看，一些商業 mAb 工藝是使用傳統的離子交換和基於疏水相互作用的純化開發的。然而，平台方法的優勢（包括穩健性和開發速度）以及高產的下一代蛋白 A 樹脂（例如粒徑分佈均勻的樹脂）的推出，意味著蛋白 A 在可預見的情況下仍將是黃金標準未來。”

Masters 所說的“破壞性純化技術”可能會發揮作用，例如膜、整體材料和最近的納米纖維形式，特別是對於大分子純化，由於目標尺寸大，樹脂的總可及結合表面積受到限制到珠子的外面。“目前正在評估這些形式的單克隆抗體製造。然而，它們在容量、適用體積、規模和高效流體動力學方面存在局限性，導致過程緩衝器的消耗顯著增加。”

親和力不僅僅適用於產品

捕獲樹脂的設計和驗證既昂貴又耗時，但一旦確定了樹脂和工藝，設計平台純化系統的潛力就足以彌補前期工作的不足。捕獲策略也適用於雜質，特別是當已知特定的表達系統會產生特定的、有問題的宿主細胞蛋白時。

2022 年 6 月，德國蛋白質工程公司 Navigo Proteins 推出了一種親和樹脂，用於從桿狀病毒昆蟲細胞表達系統中捕獲糖蛋白 gp64 污染物。Navigo 開創了 Precision Capturing ^®，一種通過將幾個色譜步驟組合（和改進）到單個捕獲操作中來簡化非 Fc 生物製劑純化的技術。例如，該公司的 Precision X 配體與 gp64 污染物特異性結合。由於此處的目標是污染物，因此樹脂以流通色譜模式使用，其中污染物與樹脂結合，但重組產物蛋白在不與樹脂相互作用的情況下洗脫。通過專注於基於表達系統的常見污染物，Precision X 可用於不止一種疫苗產品。例如，Novavax 使用該樹脂生產流感疫苗候選物。