脂質組質譜的樣品製備
脂質組學，作為一門獨立學科出現的“組學”之一，終於得到了應有的尊重。這在很大程度上要歸功於質譜 (MS)，它提供了明確的鑑定，即使對於高度支化的異構體也是如此。然而，MS 結果僅與樣品一樣好。
脂質在生物體中無處不在，並參與最關鍵的細胞過程。脂質的疏水性有助於它們充當保護細胞內部成分和工作的屏障（例如生物膜）。
結構定義準備
儘管它們具有不同的功能並且具有化學異質性，但所有脂質都含有由脂肪酸、鞘氨醇或異戊二烯結構單元構成的烴鏈。2005 年設計的脂質分類系統將脂質分為八類：脂肪酰基、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇、異戊烯醇脂、醣脂和聚酮化合物，每類都有子分類。LIPID MAPS® 結構數據庫中存在 40,000 多個條目，這是一個可公開訪問的關係數據庫，其中包含生物學相關脂質的結構和註釋。
所有脂質都溶解在非極性溶劑中，這在一定程度上簡化了脂質樣品的製備，但仍需要注意最大限度地提高回收率，尤其是低豐度物種。第一步，樣品採集，必須快速或在低於冰點的溫度下進行，以避免對關鍵物種進行酶促和化學修飾。通常，樣品環境（例如，血液與植物材料）越複雜，這種關注就越緊迫，尤其是在關注氧化時。
樣品均質性對於體液等液體樣品通常不是問題，但對於組織、細胞和許多其他固體樣品來說變得至關重要。徹底的均質化（或細胞裂解）使提取溶劑能夠接觸到樣品中的所有脂質。均質化方法包括研磨、壓碎冷凍組織、基於珠的研磨或數十種市售均質器中的任何一種。
液-液萃取實現了兩個目標：通過消除蛋白質、遺傳物質和其他脂不溶性物質來簡化樣品，並在樣品中富集感興趣的分析物。萃取溶劑的組成可以根據分析步驟進行調整，例如 MS、色譜法或分離後進行質量分析。
液-液萃取是脂質組學中最常用的樣品製備方法。在這幾種方法中，有Folch 協議和 Bligh/Dyer 方法。兩者都是基於在甲醇和氯仿之間分配樣品。甲醇會破壞脂質和蛋白質之間的聯繫，同時將釋放的脂質提取到氯仿層中。Bligh/Dyer 還使用水來誘導相分離。
已經嘗試了許多二元或三元相萃取的變體來製備植物和動物樣品以進行脂質組學分析。調整包括添加鹽酸或乙酸銨萃取步驟、水飽和丁醇（帶或不帶己烷萃取）、石油醚萃取、異丙醇沸騰然後 Bligh-Dyer 或使用異丙醇、氯仿的多步萃取方法、甲醇和水。
借來的方法
為蛋白質組學或代謝組學開發的一些通用儀器方法也適用於脂質。例如，去年 SCIEX 推出了 ZenoTOF 7600 系統，這是一種精確質量液相色譜 MS/MS 系統，它採用了 SCIEX Zeno 阱和新型離子碎裂技術電子激活解離 (EAD)。據該公司稱，這些功能提高了靈敏度。脈衝芝諾阱克服了正交 TOF 技術的傳統佔空比挑戰，提供了大大提高的靈敏度，可以對重要的低豐度分子進行常規檢測。
ZenoTOF 能夠掃描蛋白質組學的高分子量區域和代謝物的低端區域，能夠全面表徵單個脂質，包括不飽和位置和側鏈組成。
SCIEX 代謝組學和脂質組學高級經理 Maryam Goudarzi 博士表示，具有高度異構結構特異性的準確脂質 ID 是脂質組學需要克服的主要障礙。“另一個挑戰是準確量化低豐度脂質種類。纖維組織和土壤是準備分析的兩個最具挑戰性的樣品，但是一旦設置好這一步，所有樣品都會經過個性化、優化的工作流程，以確保對結構和定量數據的高度置信度。”
Goudarzi 解釋了新分析平台的重要性。“直到最近，代謝組學覆蓋的深度還受到樣本量、MS/MS 光譜豐富度和對低豐度脂質定量靈敏度的限制。該系統解決了所有三個挑戰，並通過下一代高分辨率質譜提供快速、深入的脂質分析。添加 EAD 可發現關鍵的、獨特的 MS/MS 片段，否則這些片段會被隱藏，而 Zeno 阱顯著提高了低豐度代謝物的定量。這在最近獲得的數據中最為明顯，與‘SWATH DIA’相比，我們看到在十分之一樣本負載上的註釋數量增加了兩倍。”
SWATH DIA 是一種 SCIEX“數據獨立採集”技術，可對樣品中幾乎所有可檢測的化合物進行全面檢測和定量。Zeno SWATH DIA 是該技術的下一代版本。“它是一種強大的方法，通過深入、全面和定量的代謝組學覆蓋將非靶向和靶向脂質組學結合起來，”Goudarzi 告訴 Biocompare。
填補知識空白
如此多的“組學”學科如雨後春筍般湧現的一個原因是，沒有一個學科能夠提供測試對象狀態的完整圖景。因此出現了多組學。許多這些方法直接響應藥物開發人員的特定需求。例如，專注於肝臟疾病的 Hepion Pharmaceuticals 在 2020 年推出了 AI-POWR™（人工智能——精準醫學；組學），這是一個用於基因組學、蛋白質組學、代謝組學、轉錄組學和脂質組學的人工智能 (AI) 平台。AI-POWR 有助於識別和表徵新的藥物靶點和生物標誌物，因為它們與 Hepion 正在進行的開發非酒精性脂肪性肝炎療法的項目有關。AI-POWR 從公開可用的數據庫和內部多組學“大數據”集訪問結構信息。
“經典的個體’組學研究導致僅分離出一種生物作用水平，”首席科學官 Daren Ure 博士解釋說。“任何‘組學分析’都可以識別出可作為生物標誌物或藥效學終點的藥物和疾病效應。然而，“組學”的結合揭示了完整的生物學效應並有助於確定因果關係。事實上，在我們的 2a 期研究中，脂質組學分析在被整合到具有轉錄組學、選定蛋白質組學和臨床特徵的多組學分析中之前並沒有太大幫助。只有到那時，特定的網絡才能很容易辨別。我們的多組學分析包括用於轉錄組學的 RNA 測序、用於蛋白質組學的蛋白質濃度和用於脂質組學的脂質濃度。
Hepion 專門為其方法開發了多組學管道，但使用外部實驗室來測量單個分析物。代謝組學公司 Owl 從研究對象的血清中運行 Hepion 的脂質組學分析，而轉錄組學通過分析 RNA 穩定的全血進行評估。Hepion 使用 ribo-depletion 進行總 RNA 測序，這允許在 Illumina NovaSeq 儀器上對 mRNA、pre-mRNA 和 ncRNA 進行測序。迄今為止，蛋白質組學一直專注於使用質譜法測量組織和全血中的蛋白質，並通過競爭性 ELISA 對一些膠原蛋白生物標誌物進行量化。
Hepion 的集成方法涉及多種統計處理，具體取決於數據類型。例如，在單組學與多組學 N 積分或多組學 P 積分中使用不同的工具。N-integration 是指通過多種組學方法運行的相同樣本，而 P-integration 適用於使用相同預測變量的單獨研究。
脂質的非極性性質簡化了脂質組 MS 研究的樣品製備，但實驗者必須快速處理樣品以盡量減少化學降解，並在整個過程中避免使用可能干擾 MS 分析的試劑。採取這些預防措施將確保最可靠的結果，無論脂質組學是一個獨立的目標還是更大的多組學研究的一部分。
文章作者-Angelo DePalma
Angelo DePalma 獲得了博士學位。石溪大學有機化學博士，曾任先靈葆雅高級科學家。他撰寫了大量關於生物技術、生物製造、醫療設備、醫藥商業、實驗室儀器和先進材料的文章。
