用熒光顯微鏡解鎖生物學見解

2022 年 9 月 14 日

newpowersadmin

熒光顯微鏡是細胞和分子生物學中一種強大的研究工具，隨著儀器和熒光團或熒光標記的並行發展，它一直在穩步改進。今天的熒光團毒性更小，更不易受到光漂白的影響，而且它們增強的亮度使它們更容易在組織深處檢測到。現代熒光成像平台旨在充分利用這些品質。以下是科學家如何使用當今的熒光顯微鏡工具來解決他們的生物學研究問題。

毒性更小，活力更強

如今，熒光染料對活細胞的毒性較小，對科學家更有用。有些可以發射近紅外信號，這對細胞更溫和，可以在光散射較少的情況下更深入地成像組織。“因此，我們被迫設計光學器件，以改進這些更遠的紅色波長的傳輸和校正，”尼康儀器高級生物系統培訓和資源經理 Michael Kerber 說。“結合探測器技術的不可阻擋的改進，研究人員能夠更快、更長時間地對他們的樣本進行成像，並標記更多的組件，所有這些都不會產生太多的光損傷或標籤的光譜重疊。”

更先進的熒光團和成像平台意味著研究人員可以測試關於活細胞中分子動力學的更精確的假設——例如觸發細胞事件的細胞內離子濃度的變化。“這些問題中的大多數都可以通過生物傳感器和/或熒光壽命成像來解決，”徠卡顯微系統公司生命科學研究部共焦業務部高級產品經理 Giulia Ossato 說。“FALCON 和 TauSense [在 Leica STELLARIS 共聚焦平台上] 的採集速度使研究人員能夠跟踪實時樣本中的快速動態。”

徠卡將 FALCON（快速壽命對比）集成到共聚焦顯微鏡平台中，使得非專業科學家也可以使用熒光壽命成像 (FLIM) 技術。“通過這種集成，我們將採集速度提高了 10 倍，允許使用基於熒光壽命的工具監測動態事件（例如，在活細胞中），”Ossato 補充道。STELLARIS 共聚焦平台包括一組稱為 TauSense 的生命週期衍生軟件工具，以使 FLIM 協議更易於使用。

一次合作牛津大學、紐卡斯爾大學和洛克菲勒大學最近使用 FALCON 來了解鋅轉運蛋白 ZIP7 的作用及其突變對兒童 B 細胞發育和免疫缺陷的影響。在使用 CRISPR-Cas9 誘變在小鼠中引入相同的突變後，研究人員在前 B 細胞中使用 FRET 鋅生物傳感器研究了細胞內鋅濃度。“原代細胞的內在變異性使得使用經典的基於強度的方法無法實現這種研究，”Ossato 說。“LAS X navigator 的集成和 FALCON 的速度進一步使研究人員能夠獲得使此類實驗成為可能的必要統計數據。” 結果表明，ZIP7 轉運蛋白和正常的細胞質鋅水平對於正常的 B 細胞發育和免疫反應很重要。此類研究可能會加速 ZIP7 相關免疫缺陷疾病的治療，否則會導致兒童早期感染。

Uncaging 熒光團和 2 光子顯微鏡

更亮的熒光團使研究人員能夠使用 2 光子顯微鏡觀察位於組織內更深處的細胞，這特別適合研究大腦中活神經元的快速事件。布魯克多光子和共聚焦顯微鏡產品線經理 Jimmy Fong 看到了神經科學的最新進展，即使用 2 光子熒光成像將成像和光刺激相結合。例如，研究人員使用熒光標記對神經元進行成像，並使用激光對神經元進行光遺傳學刺激。“我們已經看到這種儀器的巨大增長，將刺激與成像相結合，”Fong 說。“神經科學家現在提出的問題不僅是動物某些行為的神經迴路是什麼樣的，而且它們可以激活特定的神經元以在大腦中重演這種活動模式。”

將熒光成像與光敏分子相結合，以釋放谷氨酸等神經遞質，擴展了研究皮質神經元興奮性的工具箱。例如，在對神經元進行成像時，研究人員可以用二次激光照射特定部位的谷氨酸鹽，例如富含突觸的樹突棘，然後使用電生理學觀察這種刺激對神經元電活動的影響。

通常這是在二維成像平面上進行的，但現在研究人員可以在三個維度上研究腦組織中的皮層神經元。布魯克的空間光調製器是一種可以同時產生多個激光點的設備，並且可以定向到 3 維空間中的任何位置。“它基本上是一個全息圖，或者是樣品上的不同光點，”Fong 說。例如，全息圖可以同時在多個樹突棘上釋放谷氨酸，這在以前是不可能的，當時你不得不移動一個激光點。“你的神經元不會完全平坦，”Fong 說。“現在，您可以通過這個全息圖在三個維度上同時聚焦所有點。”

Fong 預計電壓敏感染料的改進即將到來。對於神經科學家、電生理學家和任何研究電壓依賴性過程的生物學家來說，這可能會改變遊戲規則。它還將引發顯微鏡儀器的快速創新，這些儀器必須共同發展以利用改進的電壓指示器。“為了捕捉這些電壓動態，你基本上需要以每秒 1000 幀或更高的速度對神經元進行成像，”他說。“這挑戰了當前的顯微鏡，其成像速率通常約為每秒 30-40 幀。”