核酸電泳檢查和故障排除指南
核酸電泳是分子生物學實驗室的基礎，用於為下游分子應用準備樣品，確定這些應用的結果，以及介於兩者之間的一切。入門課程中教授的基本原理很簡單：施加電流後，帶負電的 DNA（或 RNA）被拉過分子篩，使其向陽極遷移。較短的分子將移動得更快，被篩子阻礙的程度更小，從而導致基於尺寸/分子量的分離。
然而，原則上簡單的東西可能仍然有一些在 101 課程中沒有教授的實踐，但值得了解。在這裡，我們看看專家提供的一些技巧和竅門，它們可能會改善您的電泳體驗。
第一原則
絕大多數核酸分析是在由多醣瓊脂糖組成的小凝膠上進行的，較高的濃度用於分離較低分子量的條帶。這些往往作為水平（“潛艇”）迷你凝膠運行。Lakehead 大學 Paleo-DNA 實驗室技術經理 Stephen Fratpietro 指出，還可以在由聚丙烯酰胺組成的凝膠中分離核酸，從而為更小的 PCR 產物等片段提供“更好、更高的分辨率”。
曾幾何時，設備本身是電泳中的主要故障點。但是“現在的鑽機製造得非常好，以至於您不再有設備問題，”邁阿密大學生物信息學和功能基因組學中心主任兼兼職助理教授 Andor Kiss 說。它們往往不會洩漏，並且電壓非常均勻。
Kiss 解釋說，人們犯的最大錯誤之一是試圖以過高的電壓或安培數運行凝膠，最終導致瓊脂糖部分熔化或得到“那個笑臉”，或者他們對凝膠的負荷過大或不足。他建議從第一原理開始，使用設備製造商推薦的參數，或者參考像《分子克隆：實驗室手冊》這樣的指南——在其原作者之後通常簡稱為 Maniatis——並在必要時從那裡進行調整。
他說，現在大多數人在三硼酸鹽 EDTA 緩衝液 (TBE) 中運行瓊脂糖凝膠。他們過去使用三乙酸 EDTA (TAE)，因為 TBE 會干擾克隆或 PCR 等下游應用，但現在的淨化和分離試劑盒非常好，實際上沒有 TBE 的殘留。
Fratpietro 建議始終使用新鮮試劑，確保在製備凝膠時基質混合均勻，並檢查液位以確保電流有通路。
溴化乙錠 (EtBr) 曾經是在紫外光下可視化凝膠中核酸的首選染料。Kiss 指出，它仍然被廣泛使用，但由於擔心它具有毒性和致突變性，許多大學普遍不鼓勵在教學實驗室中使用 EtBr，並要求將 EtBr 染色凝膠視為危險廢物。因此，已經開發了大量（通常）熒光替代品並被廣泛採用。
超越迷你凝膠
聚丙烯酰胺凝膠——由聚合的丙烯酰胺組成，在聚合之前具有神經毒性——與瓊脂糖相比，提供了更均勻的基質、更小的孔和更高的靈敏度，能夠處理更少量的樣品。它們通常是預先購買的，或者它們可以預先製作並儲存在潮濕、涼爽的環境中，這兩者都允許“凝膠電泳比必須先製作凝膠更快地運行，”Fratpietro 指出。他建議確保樣品/染料混合物直接落到孔的底部，以確保均勻地通過基質。
Kiss 說，下一代測序 (NGS) 等要求更高的現代技術可能需要聚丙烯酰胺提供的分辨率。但是“現在最好在生物分析儀或片段分析儀上進行分析，同時提供高分辨率和更好的定量。”
製備電泳
Kiss 說，從瓊脂糖中提取和純化樣品比從聚丙烯酰胺中更容易。例如，優化 DNA 片段的大小以構建 NGS 文庫，傳統上是通過在凝膠上運行剪切的 DNA 並使用剃須刀片切出適當大小的條帶來完成的。
研究人員會觀察該 DNA 相對於大小標記階梯的位置。但 Sage Science 營銷總監 Alex Vira 指出：“與樣品相比，梯子的尺寸並不總是完美匹配。” 另一個問題是你會得到很多交叉污染——“DNA實際上會穿過凝膠遷移”到相鄰的泳道中。
Sage 設計並銷售了一系列半自動化解決方案——包括 Pippin 和 BluePippin——允許將特定大小的片段分離和捕獲到一個小的膜結合室中。“然後你用移液管將它從腔室中取出，你就可以開始了，”Kiss 說。“它消除了所有的重複和样品丟失，並且具有非常好的樣品回收率。這幾乎是黃金標準。”
Vira 說，較長片段的分離（和分離），例如 Pacific Bio 和 Oxford Nanopore 測序儀器使用的片段，可以受益於脈衝場或場反轉電泳。在這裡，電流會周期性地改變，以幫助核酸蜿蜒穿過凝膠基質。
故障排除
核酸電泳通常是常規 PCR 之後的下一個工作流程。因此，如果在運行凝膠後“凝膠沒有顯示條帶、微弱的條帶、非特異性條帶、引物二聚體或拖尾條帶”，那麼可能是時候重新審視 PCR 反應及其協議組件和試劑了，Oliver Glenn Hernaez 建議道, Bio-Rad Laboratories 生命科學事業部基因表達全球產品經理。
儘管電泳變得更加萬無一失，但在必要之前考慮一些基本的故障排除技巧總是值得的。例如，Hernaez 建議確保正確插入陽極和陰極，確保 DNA（或 RNA）從負向流向正向。監控運行，使 DNA 不會超出凝膠末端。並確保凝膠已被染色，以便核酸在紫外線下（通常）可見。
文章作者-Josh P. Roberts
Josh P. Roberts 擁有科學史和科學哲學碩士學位，他還獲得了博士學位。明尼蘇達大學分子、細胞、發育生物學和遺傳學專業，博士論文研究眼部免疫學。
