染色質分析方法

染色質由被 DNA 包裹以形成核小體的組蛋白組成，在 DNA 序列對轉錄因子或其他調節性 DNA 結合蛋白的可及性中起重要作用。完全不可接近的 DNA 被有效地沉默，而可接近的 DNA 可能正在被細胞使用。核小體的組織和有效包裝創造了一種複雜的染色質結構，可以保護和調節 DNA。因此，染色質結構和功能可以揭示有關疾病機制、表觀遺傳修飾、發育過程、細胞週期調控和許多其他領域的信息。本文將著眼於科學家用於研究染色質結構和功能的方法，包括 ATAC-seq、ChIP、基於 3C 和單細胞技術。

ATAC-seq

一種確定染色質可接近區域的常用方法是使用轉座酶 Tn5 將測序接頭插入 DNA 的可接近區域，從而進行轉座酶可接近染色質測序 (ATAC-seq) 的測定。通過 qPCR 擴增後，產物通過下一代測序 (NGS) 進行測序。

ATAC-seq 提供了一個有用的概覽，可以在一個快照中及時訪問所有 DNA。數字生物學集團 Bio-Rad Laboratories 的生物製藥部門經理 Marwan Alsarraj 指出 ATAC-seq 的易用性、強大的酶消化、無需苛刻的細胞治療以及不需要抗體。“ATAC-seq 提供了開放染色質區域的全基因組視圖，表明潛在的活躍基因開關和 TF 結合位點，而 CUT&RUN、CUT&Tag 和 ChIP-seq 使用染色質結合蛋白特異性抗體，”他說。“這導致了不同的生物學信息和解釋。” Bio-Rad 為研究單細胞水平表觀遺傳學的研究人員提供基於液滴的單細胞 ATAC-seq (scATAC-seq) 產品。

一個缺點是它不會為您提供有關開放染色質實際發生的情況的信息——只是可能會發生某些事情。“它並沒有告訴你這個轉錄因子是否真的與染色質結合，那個基因真的很活躍，還是準備被激活？” Cell Signaling Technology 的表觀遺傳學、檢測和工作流程產品高級總監 Chris Fry 說。“同樣重要的是，哪些輔因子、哪些共激活因子或共抑制因子是活躍的？” 其他缺點包括需要訪問 NGS 及其相關成本，以及細胞數量限制。

DNase-seq & MNase-seq

與 ATAC-seq 一樣，DNase-seq 和 MNase-seq 是確定特定時刻 DNA 可及性的方法，而不是依賴於核酸酶活性。DNase-seq 使用 DNase 將可訪問的序列（未受保護的常染色質）消化成片段，以供 NGS 進行後續測序。MNase-seq 使用微球菌核酸酶消化掉常染色質區域，留下受保護的異染色質（纏繞成核小體）用於 NGS 分析。

這些是完善的協議，可以與其他染色質分析方法（如 ChIP-seq）結合使用。缺點是這些方法可能需要大量樣本，這在使用稀有細胞類型時可能具有挑戰性。

ChIP-seq 和其他變體

染色體免疫沉澱 (ChIP) 是另一種常見的技術，可以採用其他技術來創建 ChIP 變異（即 ChIP-seq、ChIP-PCR、ChIP-PET、ChIP-loop）。

ChIP 首先交聯染色質（及其附近的任何其他蛋白質），捕獲有關 3D 構象關聯的信息，這些信息僅通過查看測序信息就會錯過。然後可以使用針對 DNA 相關蛋白的特異性抗體沉澱片段，然後通過 NGS 對其進行測序。與 ATAC-seq 不同，ChIP 可以通過分析特定的組蛋白修飾來提供更多的機制細節。“只需對 4 到 5 個組蛋白模塊進行採樣，您就可以了解什麼是活躍的，什麼是不活躍的，什麼是活躍的，”Fry 說。“您還可以尋找轉錄因子、輔因子和其他蛋白質。”

雖然 ChIP 是一種主力技術，但它的實用性取決於實驗的背景——在某些情況下，染色質分析的替代方法可能會更好。“ChIP-seq 的主要限制是它需要大量的輸入材料、細胞或組織才能在背景噪聲中產生足夠強的信號，以及在初始固定步驟中使用交聯，”說EpigenTek 的科學家 Michael Spelios。他指出，他們的客戶主要使用 ChIP 方法，例如 ChIP-PCR 和 ChIP-seq，以及基於酶的 CUT&RUN 和 CUT&Tag 分析來研究 DNA-蛋白質相互作用。

基於 ChIP 的方法的另一個潛在限制是需要高質量的抗體。“基於 ChIP 的方法功能強大，但其性能受到抗體可靠性的限制，”Arima Genomics 產品管理和營銷總監 Ibrahim Jivanjee 說。“Arima 已經驗證了特定的抗體，以幫助科學家在他們的實驗中更容易地使用 HiChip。”

基於 3C 的方法和變體

染色質構象捕獲 (3-C) 是一種用於研究染色質結構的鄰近連接方法（被鹼基廣泛分離的基因可以在 3 維空間中物理上非常接近）。染色質在交聯後被消化，然後通過 qPCR 和 NGS 分析相關基因。更高的通量變化包括環化 3-C（稱為 4-C）；碳拷貝 3-C（稱為 5-C）和全基因組 3C（稱為 Hi-C）。

Arima Genomics 的 Hi-C 技術可生成高分辨率的全基因組相互作用位點圖，其中包括 3D 基因組組織。“與 ATAC-seq 提供的二維染色質可及性信息不同，Arima Hi-C 提供染色體相互作用信息，使科學家能夠更好地了解染色體相互作用如何影響基因調控，”Jivanjee 說。“基於 DNase 和 3C 的構象方法也可以提供相互作用數據；然而，用戶經常遭受樣本間的差異（特別是基於核酸酶的方法），並且他們沒有提供基於 Arima 優化的 Hi-C 方法的全面的遠程交互信息。”

剪切&運行，剪切&標記

更新的基於酶的方法正變得越來越有用。CUT&RUN 方法首先使細胞透化並用特異性抗體標記它們。然後添加酶融合蛋白（由蛋白 A/G 和 MNase 製成），該蛋白將定位您的特異性抗體並在該位點切割染色質。由此產生的剪斷染色質擴散出細胞進行純化和測序。

CUT&RUN 的一個優勢是其較低的樣品要求，使其適用於原代細胞和其他數量有限的細胞類型。“雖然 ChIP 通常每個 IP 需要 1 到 400 萬個細胞，但對於 CUT&RUN，組蛋白只需 5,000 到 10,000 個細胞，轉錄因子和輔因子需要 10,000 到 20,000 個細胞，”Fry 說。與 ChIP 相比的另一個優勢是 CUT&RUN 的背景噪音較低，因為您只純化選擇性切除的染色質，而不是全部。Fry 還指出，CUT&RUN 的測序比 ChIP 更便宜、更快：“我們通常對 CUT&RUN 進行 3 到 500 萬次深度讀取，而 ChIP 通常需要 10 到 3000 萬次讀取。”

Fry 指出，經過驗證的 CUT&RUN 抗體數量仍然有限，但相信它會增長。“CUT&RUN 打開了使用原代細胞系的大門，因此我認為這將比 ChIP 更廣泛地採用只是時間問題，”他說。

CUT&Tag 方法類似於 CUT&RUN，但它在融合蛋白中使用 Tn5 轉座酶而不是 MNase。這允許它切割 DNA，並連接到含有條形碼的寡核苷酸中，用於細胞特異性標記。原位切割和標記 DNA 的能力可以簡化 NGS 文庫的製備，這有利於單細胞和多路復用應用。但 CUT&Tag 僅限於某些目標類型。它適用於組蛋白，但“僅適用於緊密結合染色質或廣泛結合染色質大區域的轉錄因子和輔助因子，”Fry 說。相比之下，CUT&RUN 適用於所有三種目標類型，細胞數較低，而 ChIP 適用於所有三種目標類型，但細胞數較高。

Spelios 指出，這兩種方法的一個缺點是融合蛋白可能導致 A/T 序列偏差。“CUT&Tag 顯示出與 CUT&RUN 相同的消化偏差，並且由於 Tn5 轉座酶導致染色質的脫靶可及性，因此特異性較低，”他說。“ EpigenTek 的 CUT&RUN 和 CUT&Tag 檢測試劑盒品牌通過獨特的裂解酶混合物規避了這些問題，該混合物具有低序列偏差並最大限度地減少免疫捕獲/測序背景，從而大大降低了輸入要求。”

單細胞染色質分析

任何使用 1000 個細胞的實驗都會給出平均結果，因此單細胞研究可以提供獨特的信息——尤其是當染色質變化太快而無法在一張快照中捕獲時。“在分析由具有不同功能的多種細胞類型組成的稀有細胞群、珍貴樣本和組織標本方面，這種技術的好處顯而易見，”Spelios 說。

越來越多的研究人員正在利用具有多模式讀數的測定法來利用單細胞多組學的可能性。例如，研究人員可以使用 ATAC 和通過測序選擇抗原譜 (ASAP-seq) 同時測定同一細胞中的表觀基因組和蛋白質組。“所有這些多模式技術，尤其是在單細胞水平上，有助於深入了解更複雜的生物相互作用，”Alsarraj 說。

研究人員已經在單細胞研究中使用 Arima 化學。“通過了解單細胞水平的 3D 基因組學，有很大的發現潛力，”Jivanjee 說。“當然，任何單細胞方法的主要挑戰之一是將獲得的信息與其他多組學技術相結合，以發展對疾病機制的新認識。”

文章作者-Caitlin Smith

Caitlin Smith 擁有里德學院的生物學學士學位和博士學位。在耶魯大學獲得神經科學博士學位，並在 Vollum 研究所完成博士後工作。