優化冷凍保存方案

冷凍保存是一種使用低溫穩定生物材料的技術，可用於從基礎研究到個性化醫療的應用。在這裡，我們來看看所涉及的內容並分享一些冷凍保存的最佳實踐。

唯一可行的長期保存技術

需要冷凍保存的樣品包括細胞系、原代細胞和實體組織樣品；精液、卵母細胞和胚胎；以及單採衍生材料，例如用於乾細胞或 T 細胞療法的材料。因此，所涉及的方法可能會隨著靈活性的程度而變化。

“在學術環境中，細胞通常可以在解凍後通過培養來恢復， ”Cytiva 冷凍生物學高級研究科學家 Peter Kilbride 博士報告說。“然而，在臨床環境中，細胞療法通常在解凍後立即註入，這意味著必須嚴格控製冷凍保存方案以提供最佳的解凍後細胞結果。”

重要的是，沒有其他技術能與冷凍保存珍貴的樣品材料相提並論。“冷凍保存是唯一可行的長期保存技術，已成功應用於保存用於研究和治療用途的生物材料，”ATCC BioNexus 基金會首席科學家 Nilay Chakraborty 博士、MBA 報告說。“通過阻止任何可能損壞或降解相關生物材料的酶或化學活動，冷凍保存可以保護許多不同樣品類型的完整性和功能。”

豐富的福利

冷凍保存最著名的應用之一是用於維持細胞系的備用庫存以進行體外研究，這對於防止數據隨著時間的推移而出現偏差並避免意外的細胞丟失至關重要。康寧技術支持專家 Markus Markowich 解釋說：“活細胞不斷暴露於可能降低其長期活力、導致形態或遺傳變化或存在污染問題的因素中，並且每次處理細胞時相關風險都會增加。”生命科學。“冷凍保存可以減輕這些影響，並防止細胞出現老化和分化的跡象，還可以減少進行日常護理的時間和費用。”

根據 Cytiva 冷凍保存工程運營經理 Chris Creasey 博士的說法，冷凍保存的進一步優勢在於它能夠安全、方便地運輸生物材料，並允許儲存不能立即使用的樣品。“這些好處對於治療應用尤其重要，以規避按需製造的固有挑戰，”他說。“冷凍保存不僅有助於確保僅在患者和臨床團隊準備好進行治療時進行治療，而且還通過提供對同一批次細胞的重複訪問來提供治療一致性。”

關鍵協議步驟

典型的冷凍保存方案涉及幾個主要步驟，每個步驟都需要針對所處理的樣品類型進行優化。首先，樣品必須轉移到合適的冷凍保存培養基中——傳統上是一種富含營養的培養基，含有 DMSO 作為冷凍保護劑，可以補充血清。“血清的作用是為細胞提供保護環境，但應該注意它有一些缺點，”美天旎生物技術公司高級科學家 Benjamin Theek 博士警告說。“這些包括可能改變解凍後恢復率的批次間差異，以及誘導幹細胞分化或原代細胞基礎激活的潛力，這可能導致下游功能分析中背景反應的增加。”

接下來，樣品必須經過控制速率冷卻。“冷卻速度取決於細胞類型，但對於哺乳動物體細胞來說，-1°C/分鐘左右的速度是最佳的，較大和更複雜的細胞結構（如球體或類器官）需要較慢的速度，”Kilbride 報告說。“可以在 -80 ^o C 冰箱中過夜的被動冷凍容器通常足以將樣品冷凍在標準冷凍管中，以用於學術研究，其中細胞被儲存起來以備將來使用，但缺乏控制和冷卻速率的可變性使得這種容器不適合用於細胞治療工作。對於這些類型的應用，Cytiva 的 VIA 冷凍控制速率冷凍機提供了符合 GMP 的無液氮解決方案。”

在控制速率冷卻之後，樣品必須轉移到液氮的氣相（196 ^o C）中進行長期儲存。在這裡，Markowich 強調了在共享存儲庫中記錄詳細信息的重要性。“對於細胞，這應該包括培養特性、傳代次數、冷凍日期、冷凍培養基和使用的方法，以及每瓶細胞的數量，”他說。“記錄最初冷凍的小瓶總數及其位置，並在每次取出小瓶時更新這些值也很重要。其他有用的信息包括預期的活力、任何質量控制測試的結果——例如不育、支原體和核型——以及細胞特異性生長參數或特徵的詳細信息。”

貼壁哺乳動物細胞系的典型冷凍保存方案

1. 用顯微鏡檢查細胞；當它們大約 85-95% 融合時，使用適當的無菌技術吸出舊培養基

2. 用不含鈣和鎂的 PBS 仔細沖洗細胞單層

3. 將預熱的細胞解離試劑（例如胰蛋白酶）添加到培養容器中，讓細胞在 37 ^o C 下孵育至少 1 分鐘，具體取決於細胞類型

4. 向容器中加入新鮮培養基，使細胞解離試劑內的蛋白水解酶反應失活

5. 將細胞轉移到置於冰上的 15 mL 離心管中

6. 從離心管中取出樣品進行計數，然後以 100 xg 離心 5 分鐘，使用離心機獲得細胞沉澱；當細胞旋轉時，計算總細胞數和活力（例如，使用台盼藍）

7. 離心後，棄去上清液，以 4 x 10 ⁶ –1 x 10 ^{7 個}細胞/mL 的密度重懸細胞沉澱在預冷的冷凍培養基中

8. 將細胞分裝到標記的冷凍管中

9. 將小瓶放入-80 ^o C 的冷凍容器中過夜

10. 將小瓶轉移到液氮的氣相中進行長期儲存，記住相應地更新細胞庫記錄

康寧生命科學提供的信息

最佳實踐建議

冷凍保存必須在特定樣本的基礎上進行仔細優化。對於培養的哺乳動物細胞的冷凍保存，推薦以下建議（基於本社論所有五位撰稿人的綜合反饋）：

• • 確保培養的細胞處於對數生長期，融合度為 85-95%，並表現出高活力
  • 記得檢測細菌、酵母菌和支原體等污染物；使用單獨的液氮罐進行檢疫將有助於在等待返回測試結果時防止污染擴散
  • ^{以 4 x 10 6} – 1 x 10 ^{7 個}細胞/mL的密度冷凍細胞以保持活力
  • 確保冷凍培養基已預冷；考慮使用針對您的特定細胞類型優化的冷凍培養基
  • 使用合適的容器以確保以 -1°C/分鐘的速度控製冷凍速度；康寧的 CoolCell® 容器是一種不含酒精的冷凍容器，可避免酒精隨時間降解的問題
  • 盡快將細胞轉移至 -80 ^o C 冰箱；如果在室溫下長時間放置，DMSO 等冷凍保護劑可能具有細胞毒性
  • ^{避免在 -80 o} C下長時間存放；這可能會損害生存能力
  • 始終將小瓶放在液氮的氣相中；將小瓶置於液相中存在污染風險，並可能導緻小瓶在解凍時爆炸

在處理其他樣本類型時，需要相應地優化冷凍保存協議。例如，在冷凍保存組織樣本時，Theek 建議將它們切成小塊，讓它們在冷凍介質中靜置幾分鐘，然後再將它們轉移到 -80 ^o C 冷凍機。“這將增加暴露於冷凍介質的表面積，以提高對組織的滲透，”他說。“在這種情況下，以及在處理原代哺乳動物細胞時，值得使用專門的冷凍介質，例如 MACS ^®冷凍溶液，以更好地保存樣品並避免使用可能影響細胞功能並使下游分析複雜化的動物成分。”

未來展望

雖然冷凍保存的最佳實踐以優化解凍後的活力為中心，但這只是冷凍保存成功的一種衡量標準。“在 ATCC，我們正在研究冷凍保存解決方案，不僅關注細胞活力，還使用先進的轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學技術進行解凍後細胞功能表徵，”Chakraborty 報告說。“通過這些努力，我們旨在解決與解凍後恢復時間、功能響應的可行性和可靠性相關的客戶痛點，這對於下一代冷凍保存技術的發展至關重要。”

文章作者-Emma Easthope

Emma Easthope 是總部位於英國的 Cambridge Technical Content Ltd 的創始人兼董事。自 2000 年畢業於坎特伯雷肯特大學獲得生物學學士學位以來，她在千禧製藥、阿斯利康和 Cellzome。她現在製作範圍廣泛的科學內容，包括 Biocompare 的常規專題。