免疫分析故障排除

當免疫測定產生不滿意的結果時，研究人員通常會責怪一抗試劑。但是，在許多情況下，一抗並沒有錯——如果處理不當，即使是“最好的”一抗也可能難以發揮作用。在這裡，我們分享了解決常見免疫測定問題的五個重要技巧。

抗體特異性、親和力和選擇性是免疫測定成功的基礎

根據 CANDOR Bioscience 的聯合創始人兼董事總經理 Tobias Polifke 博士的說法，只有當一抗以高親和力特異性結合其目標分析物時，免疫測定才能產生可靠的結果。

“任何免疫測定背後的基本原理是，抗體會結合其靶標——並且只結合其靶標——在粗基質中，”他解釋道。“如果抗體與其他生物分子結合，則結果不可信。同樣，如果抗體對其靶標的親和力較低，則它可能無法結合所有存在的靶標分子，並且交叉反應的風險會增加。在這些情況下，研究人員將異常結果歸咎於一抗是正確的。”

Aeonian Biotech 的董事兼創始人 Jan Voskuil 補充說，選擇性是決定免疫測定成功與否的另一個核心抗體特徵。“選擇性與表位的獨特性有關，因此當該表位僅在靶蛋白上發現時選擇性最大，”他說。為了更深入地研究特異性、親和力和選擇性，Aeonian Biotech 發表了 一篇博客，Cell Signaling Technology 發表了 一篇涵蓋要點的文章。

至關重要的是，高度特異性的一抗通過提高信噪比來提高檢測靈敏度。“非特異性結合會產生更高的基線噪音，從而減少測定窗口，”Cell Sciences 高級科學家 Anne Sloan 博士評論道。“儘管可以通過測定優化來降低噪音——例如通過測試不同濃度的抗體成分——使用對其目標分析物表現出高特異性的抗體是任何免疫測定靈敏度的基礎，”她說。

故障排除提示

那麼，您可以做些什麼來克服常見的免疫分析問題，例如弱信號或無信號、高背景或與假設不一致的數據？以下是我們的五個重要提示：

故障排除技巧 #1——查看協議

當遇到剛才描述的免疫測定問題時，最好的第一步是仔細審查方案，與供應商推薦的方案進行比較，包括建議的抗體濃度，”Cell 抗體應用和驗證高級總監 Katie Crosby 報告說信號技術。“即使看似很小的方案差異也可能導致結果不佳，這與抗體的質量無關，而是與影響抗體：表位相互作用的因素的複雜性有關。

故障排除技巧#2——了解目標生物學

要充分了解您的免疫測定中發生的情況，您必須了解目標生物學，尤其是因為意想不到的結果通常是最有趣的結果之一。“Western blot 是一個明顯的例子，其中翻譯後修飾、目標切割、剪接變體和多聚體都是檢測意外分子量條帶的真正原因，”Crosby 評論道。

“與其他應用相比，蛋白質印蹟的一個主要優點是它可以更容易、更快地發現非特異性結合和交叉反應等問題，”Voskuil 指出。“如果此類問題未被發現，後果可能是深遠的。例如，抗體協會最近的抗體驗證網絡研討會系列描述了使用交叉反應抗體測量乳腺癌生物標誌物雌激素受體 β 如何導致虛假的臨床試驗結果。”

疑難解答提示 #3——排除與抗體無關的問題

可歸因於非抗體試劑的問題包括受污染的緩衝液、過期的檢測試劑和不合適的洗滌液。應使用適當的陽性和陰性對照來調查這些以支持任何發現。同樣重要的是要考慮外部因素，例如環境溫度和實驗室可用的照明類型，它們會分別影響酶和熒光團的性能。

故障排除技巧 #4——始終包括相關控件

根據您的免疫測定的性質和選擇的讀數，對照可以採用多種不同的形式。“對於利用熒光檢測的測定，未染色的對照有助於了解基線自發熒光，”Crosby 說。“應定期部署二級控制，以了解該試劑而非一抗可能產生的信號（如果有）。這在處理小鼠單克隆抗體和小鼠衍生樣品時尤為重要。特徵良好的參考對照也是一個關鍵考慮因素。例如，在 IHC 分析中，特別是在處理可能不再以與原始組織相同的方式表達蛋白質的患病組織時，細胞沉澱物可作為出色的對照。”

除了這些類型的對照之外，加標實驗還可以幫助確定抗體在特定樣品基質中的表現。“加標實驗涉及在簡單溶液中以及在與您的樣品非常接近的複雜生物混合物中用純化形式的蛋白質靶標測試一抗，”Sloan 解釋道。“在此之後，您應該使用您選擇的樣本類型驗證抗體。如果您的免疫測定將包括標準曲線，則用於稀釋參考的基質應始終與樣品基質相匹配，以確保准確計算任何濃度。在這裡，確保樣品的目標蛋白濃度落在分析的動態範圍內至關重要。”

故障排除技巧 #5——採用多種測試策略

如果您遇到不滿意的免疫測定結果，交叉檢查實驗可以幫助縮小問題的根源。流行的策略包括使用多種抗體（每種針對不同的表位）運行相同的應用程序，以查看是否觀察到相似的染色；進行不同的免疫測定，例如通過使用來自以類似方式處理的相同細胞的裂解物產生蛋白質印跡來研究意外的免疫細胞化學染色（前提是抗體經過兩種技術的驗證）；並將抗體衍生的結果與正交數據進行比較，例如使用質譜法或 RNA 測序產生的數據。

使用現代試劑提高免疫測定性能

現代試劑旨在克服常見的免疫測定問題。示例包括阻斷劑，如The Blocking Solution 和SmartBlock，它們提供比 BSA 更完整的表面覆蓋以降低免疫測定變異性 (%CV)，以及抗體稀釋劑，如LowCross-Buffer ^®或 Hispec Assay Diluent (Bio-Rad)，其功能是減少交叉反應、非特異性結合和基質效應。後者可用於排除低親和力抗體，這些抗體在 PBS/BSA/Tween 中稀釋時會產生可測量的信號，但在 LowCross-Buffer 或 Hispec Assay Diluent 中稀釋時則不會。

選擇一抗時要考慮的因素

1. 檢查抗體是否已用於感興趣的應用——供應商提供的建議是一個很好的起點；證明在控制良好的實驗中使用抗體的出版物也很有幫助

2. 在審查產品數據時保持批判——供應商是否使用不止一種細胞或組織模型顯示結果？數據是否與您對目標的了解一致？是否提供了清晰詳細的協議，使您能夠複製結果？如果您遇到任何問題，供應商是否提供技術支持？

3. 了解供應商確保不同批次抗體性能一致的方法

4. 確認抗體是否識別天然或變性形式的蛋白質靶標

5. 永遠不要害怕向供應商尋求指導

文章作者-Emma Easthope

Emma Easthope 是總部位於英國的 Cambridge Technical Content Ltd 的創始人兼董事。自 2000 年從坎特伯雷的肯特大學獲得生物學學士學位以來，她在包括 Millennium Pharmaceuticals、Millennium Pharmaceuticals、阿斯利康和 Cellzome。她現在製作範圍廣泛的科學內容，包括 Biocompare 的常規功能。