選擇正確的細胞檢測
基於細胞的測定是藥物發現和開發的支柱。然而，有這麼多不同類型的細胞檢測方法可供選擇，您如何選擇適合您的實驗需求的一種？本文著眼於這些檢測中最受歡迎的一些檢測、它們之間的相互關係以及如何在其中進行選擇。
為什麼是基於細胞？
使用基於細胞的測定使我們能夠探討化合物或遺傳或環境變化對基因表現或蛋白質分泌的影響。 Molecular Devices 應用團隊高級經理 Oksana Sirenko 解釋說，它可以在全細胞層面觀察更複雜的事件，例如細胞分裂、細胞凋亡或細胞死亡。
可以對正常原代細胞或永生化細胞系、編輯或轉染的細胞、患者來源的細胞或幹細胞來源的細胞進行測定。它們可以在 2D 或 3D 培養物或單細胞懸浮液上進行。一般來說，統一因素是測定是在（通常）完整的活細胞體外進行的，而不是裂解物或萃取物。他們尋找功能變化，儘管這些變化可以透過生化手段來測量。
它還活著（還是是？）
最常見的基於細胞的測定只是計算存在的活細胞的數量。 「主要目標通常只是測量細胞活力，但對於幾乎所有其他基於細胞的測定來說，了解實驗結束時有多少細胞都是有幫助的，」Promega 細胞健康科學大使 Terry Riss 說。 「你可能想知道有多少活細胞，或有多少死細胞。或者如果它們死了，它們是怎麼死的——是細胞凋亡事件嗎？所有這些資訊都是理解基於細胞的檢測的其他方面的關鍵。
活力的經典定義是基於膜的完整性。當細胞最終死亡時，其細胞膜開始滲漏，細胞內所含的物質可以逃逸到細胞培養基中，例如胞質酶乳酸脫氫酶 (LDH)。透過添加由 LDH 轉化為可量化產物（例如螢光或發光）的底物，可以估計異質群體中非存活細胞的數量。
同時，培養基中被排除在活細胞以外的染料或底物等物質現在可以進入細胞膜完整性受損的細胞中。例如，所謂的「活體染料」（例如碘化丙啶和台盼藍）進入細胞，表示細胞無活力。
許多檢測都是基於這樣一個事實：隨著細胞死亡，代謝活動會減弱然後停止。四唑 (MTT) 等試劑甚至可以輕鬆進入活細胞。活細胞的內源性細胞機制會減少化合物，要麼改變它們在給定波長下的吸光度（可以透過標準板讀數器等比色計測量），要麼使它們發出螢光（透過螢光計讀取），或兩者兼而有之。里斯說，這些可能是高通量篩選實驗室之外「最常用的衡量活力的方法」。
在高通量篩選實驗室中，最常見的是 CellTiter-Glo ® (CTG) ATP 檢測。 「細胞一旦死亡，它就會失去合成 ATP 的能力，並且現有的 ATP 會被所有使用 ATP 的酶耗盡，因此 ATP 被用作活細胞數量的標記，」Riss 解釋道。 CTG 裂解細胞並使用 ATP 使檢測的螢光素/螢光素酶反應產生發光。他說，這是最快、最靈敏的檢測方法，幹擾因素最少。但它殺死細胞的事實限制了隨後對這些細胞的處理。
復用，依序
通常，研究人員需要了解的不僅僅是治療後有多少比例的細胞存活或生長。例如，這種治療是否會導致細胞增殖、壞死或凋亡？它是否會導致細胞活化或抑制特定的訊號通路，或上調或下調某種受體？
許多針對這些後遺症的測定都是在培養細胞（而不是裂解細胞）中進行的。例如，可以在培養開始時添加膜聯蛋白 V 以及碘化丙啶，以分別識別凋亡細胞和壞死細胞。這些測定的同質版本允許即時跟踪，而無需幹預洗滌步驟。雖然某些測定可以一起或順序進行，但了解所涉及的化學成分（包括讀數，例如螢光激發和發射波長）非常重要，以確保它們相容。
細胞係也可用於或可被改造以查詢特定事件。 「例如，如果你想建立一種基於細胞的測定法來測量SARS 冠狀病毒的感染性，或者觀察冠狀病毒的變體，你可以使用帶有或不帶有受體的特定靶細胞來創建基於細胞的測定法， “BPS Biosciences 高級行銷總監 Dzung Nguyen 解釋。 「然後你會使用像慢病毒這樣的東西來表達刺突蛋白以及它傳遞給細胞的某種報告基因。一旦發生感染，您就可以使用螢光素酶或 GFP 等進行讀數。
他引用了使用工程細胞進行基於細胞的測定的另一個例子，利用具有驅動螢光素酶報告基因的啟動子序列的細胞系。訊號傳導途徑或受體結合可能會活化轉錄因子，從而活化啟動子以誘導螢光素酶的表達。
想像一下 3D 場景
並非所有基於細胞的測定都僅使用顏色、發光或螢光作為讀數。 Sirenko 指出：“成像可以分析從細胞死亡、增殖和凋亡到分化標記物的出現和鈣分離的動力學監測等多種過程。” “你可以想像形態的變化，或複雜的過程，例如心肌細胞的收縮。”
她看到了行業趨勢，轉向更複雜的基於細胞的檢測，可能使用具有高內涵成像的表型檢測，“甚至是基於 3D 細胞的檢測，以進行高通量篩選。” 3D 模型代表組織功能的某些方面，例如肝臟的代謝活動、神經元活動的峰值或細胞滲透，並且更接近模擬細胞類型之間的相互作用。
如何選擇
Nguyen 會問的第一個問題是：“細胞系統是否適合準確測量你想要測量的東西？”
里斯要求你最後考慮一下你想知道什麼。例如，簡單計數活（或死）細胞的實驗可能無法直接測量增殖或細胞毒性，也不能詳細說明藥物的作用機轉。
其他要問的問題包括：您是否想要進行多重檢測（成本更高但更快），還是僅對選定的少數細胞進行第二次檢測？這些檢測會互相干擾嗎？
讀數是什麼？成像通常需要更複雜的設定、設備和分析，但可以相應地產生更多資訊。還是您喜歡發光的靈敏度和速度、螢光的定位和多重能力，還是比色法的節儉？
盡量減少步驟、選擇同質檢測是否重要？
有關規劃和運行基於細胞的測定的更多注意事項，請參閱“體外細胞測定”，國家醫學圖書館測定指導手冊的一部分。
選擇基於細胞的檢測時要考慮什麼
靈敏度
速度
使用方便
儀器儀表
成本
讀出
變化性
多路復用
2D 與 3D
文章作者-Josh P. Roberts
喬許·P·羅伯茨 (Josh P. Roberts) 擁有科學史和科學哲學碩士學位，並獲得了博士學位。明尼蘇達大學分子、細胞、發育生物學和遺傳學項目，論文研究方向為眼部免疫學。
